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b
C, G oder T (nicht A)
d
A, G oder T (nicht C)
h
A, C oder T (nicht G)
v
A, C oder G (nicht T)
w
A oder T (schwach)
s
C oder G (stark)
r
A oder G (Purin)
y
C oder T (Pyrimidin)
m
A oder C (Amino)
k
G oder T (Keto)

Name	Sequenz ?	Überhang	Eigenschaften ?	Isoschizomere
Aat II	G↑ACGT↓C	3′ ACGT	37° IV 65° CpG FcB	ZraI*
Acc I	GT↓MK↑AC	5′ MK	37° IV 80° CpG FcB	Bsh1236I, BspFNI, BstFNI, BstUI, MvnI
Acc III	T↓CCGG↑A	5′ CCGG	65° AccIII No Dam	Aor13HI, BseAI, Bsp13I, BspEI, Kpn2I, MroI
Acu I	CTGAAGN₁₄↑NN↓	3′ NN	37° IV 65° FcB	Eco57I
Afl II	C↓TTAA↑G	5′ TTAA	37° IV 65° FcB	BfrI, BspTI, BstAFI, MspCI, Vha464I
Age I	A↓CCGG↑T	5′ CCGG	37° IV 65° CpG FcB	AsiGI, BshTI, CspAI, PinAI
Alw I	GGATCNNNN↓N↑	5′ N	37° IV No Dam FcB	AclWI, BspPI
Alw26 I	GTCTCN↓NNNN↑	5′ NNNN	37° IV 65° CpG FcB	BcoDI, BsmAI, BstMAI
Apa I	G↑GGCC↓C	3′ GGCC	25° IV 65° CpG Dcm FcB	Bsp120I, PspOMI
ApaL I	G↓TGCA↑C	5′ TGCA	37° IV No CpG FcB	Alw44I, VneI
Apo I	R↓AATT↑Y	5′ AATT	50° III 80° FcB	AcsI, XapI
Asc I	GG↓CGCG↑CC	5′ CGCG	37° IV 65° CpG FcB	PalAI, SgsI
Ava I	C↓YCGR↑G	5′ YCGR	37° IV 80° CpG FcB	Ama87I, BmeT110I, BsiHKCI, BsoBI, Eco88I
Ava II	G↓GWC↑C	5′ GWC	37° IV 80° CpG Dcm FcB	Bme18I, Eco47I, SinI, VpaK11BI
Avr II	C↓CTAG↑G	5′ CTAG	37° IV 80° FcB	AspA2I, BlnI, XmaJI
Bal I	TGG⇅CCA	Blunt	37° BalI 65° Dcm	MlsI, MluNI, Mox20I, MscI, Msp20I
BamH I	G↓GATC↑C	5′ GATC	37° BamHI No FcB	-
Bcl I	T↓GATC↑A	5′ GATC	50° III No Dam FcB	FbaI, Ksp22I
Bgl I	GCCN↑NNN↓NGGC	3′ NNN	37° III 65° CpG FcB	-
Bgl II	A↓GATC↑T	5′ GATC	37° III No FcB	-
Bsa I	GGTCTCN↓NNNN↑	5′ NNNN	37° IV 65° CpG Dcm FcB	Bso31I, BspTNI, Eco31I
BsaW I	W↓CCGG↑W	5′ CCGG	60° IV 80° FcB	-
BsiW I	C↓GTAC↑G	5′ GTAC	55° III 80° CpG FcB	Pfl23II, PspLI
BsmB I	CGTCTCN↓NNNN↑	5′ NNNN	55° III 80° CpG FcB	Esp3I
BsoB I	C↓YCGR↑G	5′ YCGR	37° IV 80° FcB	Ama87I, AvaI, BmeT110I, BsiHKCI, Eco88I
BspE I	T↓CCGG↑A	5′ CCGG	37° III 80° CpG Dam FcB	AccIII, Aor13HI, BseAI, Bsp13I, Kpn2I, MroI
BsrF I	R↓CCGG↑Y	5′ CCGG	37° IV No CpG FcB	Bse118I, BssAI, Cfr10I
BstY I	R↓GATC↑Y	5′ GATC	60° II 80° FcB	BstX2I, MflI, PsuI
BtsC I	GGATG↑NN↓	3′ NN	50° IV 80° FcB	BseGI, BstF5I, FokI*
Cfr10 I	R↓CCGG↑Y	5′ CCGG	37° Cfr10I No CpG FcB	Bse118I, BsrFI, BssAI
Cfr42 I	CC↑GC↓GG	3′ GC	37° I 65° CpG FcB	KspI, SacII, Sfr303I, SgrBI
Cfr9 I	C↓CCGG↑G	5′ CCGG	37° III 65° CpG	SmaI*, TspMI, XmaI
Cla I	AT↓CG↑AT	5′ CG	37° IV 65° CpG Dam FcB	Bsa29I, BseCI, BshVI, BspDI, Bsu15I, BsuTUI
CviA I	↓GATC↑	5′ GATC	37° IV 65° Dam FcB	-
Dde I	C↓TNA↑G	5′ TNA	37° III 65° FcB	BstDEI, HpyF3I
Dpn I	GA⇅TC	Blunt	37° IV 80° FcB	MalI
Dpn II	↓GATC↑	5′ GATC	37° DpnII 65° Dam FcB	Bsp143I, BssMI, BstKTI*, BstMBI, Kzo9I, MboI, NdeII, Sau3AI
Dra I	TTT⇅AAA	Blunt	37° IV 65° FcB	-
Eag I	C↓GGCC↑G	5′ GGCC	37° III 65° CpG FcB	BseX3I, BstZI, EclXI, Eco52I
Eco47 I	G↓GWC↑C	5′ GWC	37° III 65° CpG Dcm FcB	AvaII, Bme18I, SinI, VpaK11BI
EcoN I	CCTNN↓N↑NNAGG	5′ N	37° IV 65° FcB	BstENI, XagI
EcoO109 I	RG↓GNC↑CY	5′ GNC	37° IV 65° Dcm FcB	-
EcoR I	G↓AATT↑C	5′ AATT	37° EcoRI 65° CpG FcB	-
EcoR V	GAT⇅ATC	Blunt	37° III 65° CpG FcB	Eco32I
EcoT38 I	G↑RGCY↓C	3′ RGCY	37° IV 65° FcB	BanII, Eco24I, FriOI
Esp3 I	CGTCTCN↓NNNN↑	5′ NNNN	37° IV 65° CpG FcB	BsmBI
Fok I	GGATGN₉↓NNNN↑	5′ NNNN	37° IV 65° CpG Dcm FcB	BseGI, BstF5I, BtsCI*
Fsp I	TGC⇅GCA	Blunt	37° IV 65° CpG FcB	Acc16I, NsbI
Hae II	R↑GCGC↓Y	3′ GCGC	37° IV 80° CpG FcB	BfoI, BstH2I
Hae III	GG⇅CC	Blunt	37° IV 80° FcB	BshFI, BsnI, BimgI, BsuRI
Hga I	GACGCN₅↓NNNNN↑	5′ NNNNN	37° I 65° CpG FcB	CseI
Hinc II	GTY⇅RAC	Blunt	37° IV 65° CpG FcB	HindII
XmaI	C↓CCGG↑G	5′ CCGG	37° IV 65° CpG FcB	Cfr9I, SmaI*, TspMI
Hind II	GTY⇅RAC	Blunt	37° II 65° CpG FcB	HincII
Hind III	A↓AGCT↑T	5′ AGCT	37° II 80° FcB	-
Hinf I	G↓ANT↑C	5′ ANT	37° IV 80° CpG FcB	-
HinP1 I	G↓CG↑C	5′ CG	37° II 65° CpG FcB	AspLEI, BstHHI, CfoI, HhaI, Hin6I, HspAI
Hpa I	GTT⇅AAC	Blunt	37° IV No CpG FcB	KspAI
Hpa II	C↓CG↑G	5′ CG	37° IV 80° CpG FcB	BsiSI, HapII, MspI
Hph I	GGTGAN₇↑N↓	3′ N	37° IV 65° Dam FcB	AsuHPI
Hpy188 I	TC↑N↓GA	3′ N	37° IV 65° Dam FcB	-
Hpy99 I	↑CGWCG↓	3′ CGWCG	37° IV 65° CpG FcB	-
HpyCH4 V	TG⇅CA	Blunt	37° IV 65° FcB	-
Kpn I	G↑GTAC↓C	3′ GTAC	37° I No FcB	Acc65I, Asp718I
Kpn2 I	T↓CCGG↑A	5′ CCGG	55° I 80° CpG FcB	AccIII, Aor13HI, BseAI, Bsp13I, BspEI, MroI
Lsp1109 I	GCAGCN₈↓NNNN↑	5′ NNNN	37° III 65° FcB	BbvI, BseXI, BstV1I
Mbo I	↓GATC↑	5′ GATC	37° III 65° CpG Dam FcB	Bsp143I, BssMI, BstKTI*, BstMBI, DpnII, Kzo9I, NdeII, Sau3AI
Mbo II	GAAGAN₇↑N↓	3′ N	37° II 65° Dam FcB	-
Mlu I	A↓CGCG↑T	5′ CGCG	37° III 65° CpG FcB	-
Xho I	C↓TCGA↑G	5′ TCGA	37° IV 80° CpG FcB	PaeR7I, Sfr274I, SlaI
Mnl I	CCTCN₆↑N↓	3′ N	37° II 65° FcB	-
Mse I	T↓TA↑A	5′ TA	37° IV 65° FcB	SaqAI, Tru1I, Tru9I
Msp I	C↓CG↑G	5′ CG	37° IV No FcB	BsiSI, HapII, HpaII
MspA1 I	CMG⇅CKG	Blunt	37° IV 65° CpG FcB	-
Mun I	C↓AATT↑G	5′ AATT	37° II 65° FcB	MfeI
Nae I	GCC⇅GGC	Blunt	37° I 65° CpG FcB	MroNI, NgoMIV, PdiI
Nco I	C↓CATG↑G	5′ CATG	37° III 65° FcB	Bsp19I
Nde I	CA↓TA↑TG	5′ TA	37° IV 65° FcB	FauNDI
NgoM IV	G↓CCGG↑C	5′ CCGG	37° IV 80° CpG FcB	MroNI, NaeI, PdiI
Nhe I	G↓CTAG↑C	5′ CTAG	37° II 65° CpG FcB	AsuNHI, BmtI, BspOI
Nla IV	GGN⇅NCC	Blunt	37° IV 65° CpG Dcm FcB	BmiI, BspLI, PspN4I
Not I	GC↓GGCC↑GC	5′ GGCC	37° III 65° CpG FcB	CciNI
Nru I	TCG⇅CGA	Blunt	37° III 65° CpG Dam FcB	Bsp68I, BtuMI, RruI
Nt.BstNB I	GAGTCNNNN↓	Nicht vorhanden	55° III 80° FcB	-
PaeR7 I	C↓TCGA↑G	5′ TCGA	37° IV No CpG FcB	Sfr274I, SlaI, XhoI
PflM I	CCAN↑NNN↓NTGG	3′ NNN	37° III 65° Dcm FcB	AccB7I, Van91I
Ple I	GAGTCNNNN↓N↑	5′ N	37° IV 65° CpG FcB	MlyI, PpsI, SchI
PluT I	G↑GCGC↓C	3′ GCGC	37° IV 65° CpG FcB	DinI, EgeI, EheI, KasI, SfoI
PspG I	↓CCWGG↑	5′ CCWGG	37° IV No Dcm	AjnI, BciT130I, BseBI, BstNI, Bst2UI, EcoRII, MvaI*, Psp6I
Pst I	C↑TGCA↓G	3′ TGCA	37° III 80° FcB	BspMAI
Xba I	T↓CTAG↑A	5′ CTAG	37° IV 65° Dam FcB	-
Tth111 I	GACN↓N↑NGTC	5′ N	65° IV No FcB	PflFI, PsyI
TspM I	C↓CCGG↑G	5′ CCGG	75° IV No CpG FcB	Cfr9I, SmaI*, XmaI
Taq I	T↓CG↑A	5′ CG	65° III 80° Dam FcB	-
Swa I	ATTT⇅AAAT	Blunt	25° III 65° FcB	SmiI
Pvu I	CG↑AT↓CG	3′ AT	37° III No CpG FcB	Ple19I
Pvu II	CAG⇅CTG	Blunt	37° II No FcB	-
Rsa I	GT⇅AC	Blunt	37° IV 65° CpG FcB	AfaI, Csp6I, CviQI, RsaNI*
Sac I	G↑AGCT↓C	3′ AGCT	37° I 65° FcB	Ecl136II, EcoICRI, Eco53kI*, Psp124BI, SstI
Sac II	CC↑GC↓GG	3′ GC	37° IV 65° CpG FcB	Cfr42I, KspI, Sfr303I, SgrBI
Sal I	G↓TCGA↑C	5′ TCGA	37° III 65° CpG FcB	-
Sau96 I	G↓GNC↑C	5′ GNC	37° IV 80° CpG Dcm FcB	AspS9I, BmgT120I, Cfr13I, PspPI
Sbf I	CC↑TGCA↓GG	3′ TGCA	37° IV 80° FcB	SdaI, Sse8387I
Sca I	AGT⇅ACT	Blunt	37° III 80° FcB	ZrmI
Sda I	CC↑TGCA↓GG	3′ TGCA	37° IV 80° FcB	SbfI, Sse8387I
Sfi I	GGCCN↑NNN↓NGGCC	3′ NNN	50° II No CpG Dcm FcB	-
SgrA I	CR↓CCGG↑YG	5′ CCGG	37° IV 65° CpG FcB	-
Sma I	CCC⇅GGG	Blunt	25° IV 65° CpG FcB	Cfr9I, TspMI, XmaI*
SnaB I	TAC⇅GTA	Blunt	37° IV 80° CpG FcB	BstSNI, Eco105I
Spe I	A↓CTAG↑T	5′ CTAG	37° IV 80° FcB	AhlI, BcuI
Sph I	G↑CATG↓C	3′ CATG	37° II 65° FcB	PaeI
Sse9 I	↓AATT↑	5′ AATT	55° I 65° FcB	MluCI, TasI
Ssp I	AAT⇅ATT	Blunt	37° IV 65° FcB	-
Stu I	AGG⇅CCT	Blunt	37° IV 65° Dcm FcB	Eco147I, PceI, SseBI
StyD4 I	↓CCNGG↑	5′ CCNGG	37° IV 65° CpG Dcm FcB	Bme1390I, BmrFI, BstSCI, MspR9I, ScrFI

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Restriktionsendonukleasen

Was sind Restriktionsenzyme?

Restriktionsenzyme sind Enzyme, die kurze DNA-Sequenzen erkennen und schneiden können. Die auch als Restriktionsendonukleasen bezeichneten Enzyme treten unter anderem in Bakterien auf und dienen dort der Abwehr von Bakteriophagen. Insgesamt werden die Restriktionsenzyme in 4 Typen klassifiziert, die sich in der Spezifität der Spaltung und in der Struktur der Untereinheiten unterscheiden.

Bisher wurden etwa 3000 unterschiedliche Restriktionsenzyme beschrieben, die über 230 verschiedene DNA-Sequenzen erkennen. Restriktionsenzyme werden weltweit routinemäßig zur Modifizierung von DNA eingesetzt und sind ein unverzichtbares Werkzeug in allen molekularbiologischen Laboren.

Eine kurze Geschichte der Restriktionsenzyme

Die Grundlagen zur Erforschung der Restriktionsenzyme gehen auf die Arbeiten von Luria et al. zu Beginn der 1950er Jahre zurück [1]. Das Team um Luria beobachtete, dass der Bakteriophage λ gut in einem E. coli-Stamm (z.B. E. coli C) wachsen konnte, in anderen Stämmen (z. B. E. coli K) allerdings ein schlechtes Wachstum aufwies. Die Wirtszelle (in diesem Fall E. coli K) wurde als Restriktionswirt beschrieben, mit der Fähigkeit die biologische Aktivität des Phagen λ zu verringern.

Der Begriff Restriktionsenzym wurde erstmals in den 1960er Jahren in den Laboratorien von Arber und Meselson erwähnt. Arber und Meselson haben herausgefunden, dass die Restriktion durch eine enzymatische Spaltung der Phagen-DNA verursacht wird. Das an diesem Prozess beteiligte Enzym wurde als „Restriktionsenzym“ bezeichnet [2, 3]. Die von Arber und Meselson untersuchten Restriktionsenzyme waren Restriktionsenzyme vom Typ I, die DNA an zufälligen Stellen abseits der Erkennungsstelle spalten.

Im Jahr 1970 isolierten und beschrieben das Team um Smith das erste Restriktionsenzym des Typs II: Hind II [4]. Restriktionsenzyme vom Typ II sind für molekularbiologische Labore viel nützlicher, da Sie die DNA an der Stelle ihrer Erkennungssequenz schneiden. Für die Entdeckung der Restriktionsenzymen und ihrer Anwendung auf die Molekulargenetik erhielten Smith, Arber und Nathans 1978 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie.

Erkennungssequenzen

Alle Restriktionsenzyme erkennen eine spezifische DNA-Sequenz. Die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme bestehen meist aus palindromischen Sequenzen, die gegenläufig bei komplementärer Basenpaarung die gleiche Basenfolge haben. Der Schnitt kann entweder in der Mitte beider DNA-Stränge erfolgen, wodurch sogenannte „blunt ends“ erhalten werden, oder versetzt sein, wodurch klebrige Enden („sticky ends“) erzeugt werden.

Typen von Restriktionsenzymen

Basierend auf der Struktur, den Cofaktoranforderungen und der Spezifität der Spaltung werden vier Typen von Restriktionsenzymen unterschieden.

Typ I Restriktionsenzyme schneiden die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt. Diese Enzyme benötigen sowohl ATP als auch S-Adenosyl-Methionin.

Typ II Restriktionsenzyme schneiden die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz. Diese Enzyme benötigen kein ATP und haben keine Methyltransferase-Aktivität. Restriktionsenzyme vom Typ II sind für die molekularbiologische Arbeiten am geeignetsten. Alle Restriktionsenzyme von NIPPON Genetics EUROPE sind vom Typ II.

Typ III Restriktionsenzyme spalten die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Diese Enzyme benötigen kein ATP und transferieren eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin.

Typ IV Restriktionsenzyme schneiden nur methylierte/hydroxymethylierte DNA. Dagegen werden die Restriktionsenzyme vom Typ I-III durch Methylierungen gehemmt.

Doppelverdau

Eine Vektor- und eine Insert-DNA können durch Schneiden mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen kloniert werden, wodurch zwei unterschiedliche Restriktionsenden erzeugt werden. Diese Strategie verhindert, dass der Vektor ohne Insert ligiert wird, was zu einer starken Verringerung der Selbstligation und einer Erhöhung der Klonierungseffizienz führt. Die meisten unserer Restriktionsenzyme sind im FastCut Buffer zu 100 % aktiv, was die Doppelverdauung einfach macht. Bitte sehen Sie sich die Leistungstabelle an, um einen Doppelverdau mit den vier Standardpuffern durchzuführen.

FastGene^® Double Digest Tabelle (download)

Aktivität des einzigartigen FastGene^®-Puffers

NIPPON Genetics EUROPE bietet vier Standardpuffer, die die Aktivität jedes Restriktionsenzyms in dem mit dem Enzym gelieferten Puffer maximal unterstützen. Einige Restriktionsendonukleasen erfordern jedoch einen einzigartigen Puffer für maximale Aktivität. Sehen Sie sich die folgende Tabelle an, um einen Puffer für die Doppelverdauung auszuwählen, wenn ein Restriktionsenzym einen einzigartigen Puffer erfordert. Aufgelistet sind die Aktivitäten (%) der am häufigsten verwendeten Restriktionsendonukleasen in den fünf einzigartigen FastGene^®-Puffern für EcoR I, BamHI, Acc III, Bal I bzw. Dpn Il. Ein Restriktionsenzym ist normalerweise in einem einzigen Puffer aktiv, wenn es in einem der vier Standardpuffer aktiv ist. Daher ist es möglich, einen Doppelverdau in einem bestimmten einzigartigen Puffer durchzuführen. Wenn die Verdauungseffizienz aufgrund des suboptimalen Puffers gering ist, erhöhen Sie die Menge an Restriktionsendonukleasen oder inkubieren Sie über einen längeren Zeitraum.

FastGene^® Double Digest Tabelle (download)

Literaturangaben

[1] Luria and Human (1952) A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J Bacteriol., 557-569.

[2] Arber and Linn (1969) DNA modification and restriction. Annu Rev Biochem., 467-500.

[3] Meselson and Yuan (1968) DNA restriction enzyme from E. coli. Nature, 1110-1114

[4] Smith and Wilcox (1970) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol., 379-391.