Kit Scriptase II ADNc FastGene (100)

Ligation de brins d'ADN

Le Kit Scriptase II FastGene® (100 réactions) contient la Scriptase II FastGene, un tampon enzymatique, des dNTPs, des oligo dTs, des hexamères aléatoires et un inhibiteur de RNase.

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Numéro de catalogue LS63
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Détails

Enzyme d’ingénierie

Les transcriptases inverses génétiquement modifiées permettent la synthèse d’ADNc à partir de très faibles quantités d’ARN. Des mutations sont insérées dans le domaine RNase H de la transcriptase inverse MuLV. Par conséquent, en ne dégradant pas l’ARN pendant la synthèse du premier brin, un rendement plus élevé en ADNc entier est obtenu. De plus, une stabilité thermique plus élevée augmente la robustesse de l’enzyme.

La Scriptase II FastGene® est exactement l’une de ces enzymes d’ingénierie. Avec sa mutation dans le domaine RNase H et sa stabilité thermique supérieure, elle constitue le choix optimal pour des utilisations plus complexes, telles que des RT-qPCR et du NGS.

Applications
  • Quantification de l’expression des gènes
  • RT-qPCR
  • Séquençage NGS
  • Faible concentration d’ARN
  • Matrices complexes
Activité RNase H plus faible pour des ADNc plus longs

La Scriptase II FastGene® a un domaine RNase H modifié. L’ARN n’est donc pas dégradé et sert de matrice pour des ADNc plus longs, ce qui permet d’obtenir une taille de fragments pouvant atteindre 12 kpb.

Enzymes d’ingénierie – optimisées pour la qPCR

La Scriptase II FastGene® fournit des matrices ADNc de qualité supérieure pour ses utilisations en aval, par exemple pour de la qPCR et du NGS. L’ADNc entier obtenu donne une image complète du gène et permet de mettre en évidence des modifications, comme des variants d’épissage.

Comparaison de différents résultats de PCR
– PCR multiplexe

Fig. 1 : Comparaison de la PCR multiplexe utilisant l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I et la Scriptase II FastGene® à 42 et à 50 °C.

– qPCR

Fig. 2 : Comparaison des résultats de qPCR avec des amorces pour la GAPDH et l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I, et la Scriptase II FastGene® à 42 °C, en utilisant différentes concentrations initiales d’ARN.

Fig. 3 : Comparaison des résultats de qPCR avec des amorces pour YWHAZ et l’ADNc produit par l’enzyme SS-II du concurrent I, et la Scriptase II FastGene® à 42 °C, en utilisant différentes concentrations initiales d’ARN.

Documents

LS63_FG-Scriptase-II-cDNA-Kit_TDS_vers.2020
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Technical Note

FAQ

Quelle concentration est recommandée pour des amorces spécifiques d’un gène avec LS63 ?

Nous recommandons l’utilisation de 15 à 20 pmol pour des amorces spécifiques d’un gène.


Quel est l’objectif de l’étape à 42 °C pendant 2 min, et le rendement diminuera-t-il significativement si je saute cette étape ? Si j’utilise une amorce oligo dT, puis-je sauter cette étape ?

Le but de cette étape est l’hybridation de l’amorce. Pour l’oligo dT, il est généralement recommandé d’effectuer une étape d’hybridation à 42 °C pendant 2 minutes, car son Tm est faible.

Le rendement n’est pas influencé si la quantité de matrice est suffisante et si les amorces fonctionnent correctement (bien conçues). Dans ce cas, vous pouvez ignorer l’étape. Mais si la quantité de matrice est faible et que les amorces ne sont pas optimisées, nous nous attendons à ce que le rendement soit affecté.

Dans le protocole, l’étape d’hybridation pour oligo dT est une standard. Pour certaines cibles, une température de 40 °C pendant 2 minutes ou de 37 °C pendant 2 minutes, etc., pourrait être meilleure pour des expériences en temps réel qu’une température de 42 °C. Cela signifie qu’il est possible que vous deviez optimiser de manière empirique la température de réaction, le temps et les étapes pour votre cible.


Est-ce que je peux utiliser le Kit Scriptase II ADNc avec une grosse quantité d’ARN (2,5 µg / 20 µL) ?

Nous recommandons un maximum d’1 µg. La raison : les gènes très exprimés seront proportionnellement surreprésentés dans une concentration aussi élevée. Signifiant que les chances de trouver un ARNm très concentré sont plus hautes que pour les ARNm à faible concentration. Avec 1 µg, la quantité d’enzyme par ARNm sera bien plus haute, garantissant la RT totale de chaque ARNm.


Est-ce que l’Enzyme est influencée par du DEPC ?

Si le DEPC n’est pas complètement enlevé, cela peut inhiber toute réaction enzymatique, incluant la Scriptase II.

4 avis pour Kit Scriptase II ADNc FastGene (100)

  1. Haruko Hayasaka Immunohole Functional Lab., Dept. Bioscience and Biotechnology, Kinki University

    I especially like that the Scriptase II lead to stable results. As a result of performing RT-PCR using tumor derived RNA, we were able to detect the expression of genes whose amplification was unstable with other RT reagents. The Amplification of full-length cDNA has also been confirmed. I would love to also try the 5x Ready Mix.

  2. Ryo Mameda, Department of Biomolecular, Graduate School of Engineering, Tohoku University, Japan

    PCR amplified DNA fragement was cloned into a vector and the sequence was confirmed. As a result, there was no artificial mutation such as changes of single nucleotides.

    Also, the manual of your product (FastGene® Scriptase II cDNA Synthesis Kit) was very easy to understand and I felt no stress on the operation. I definitely want to use other products from NIPPON Genetics.

  3. Dr. Catherine Moermans, pneumology department, CHU-ULiège, Liège, Belgium

    “The FastGene® scriptase II cdna synthesis kit appeared to be a reliable method to perform RT-PCR experiments using induced sputum samples which is a difficult specimen matrix. Indeed, it allowed to obtain a good reproducibility and good amplification curve profils. Furthermore, the cost of this product is really cheap compared to what we use to buy.”

    Translation by Nippon Genetics:

    Das FastGene® Scriptase II cDNA Kit zeichnet sich als zuverlässige Methode aus um RT-PCR Experimente mit Proben eines induzierten Suptums durchzuführen. Obwohl dies eine schwere Probenmatrix ist, konnte eine gute Reproduzierbarkeit und ein gutes Amplifikationskurvenprofil gewonnen werden. Zusätzlich sind die Kosten verglichen zu dem zuvor verwendetem Produkt sehr preisgünstig.

  4. Nathalie Renotte, Cellular and Molecular Epigenetics, GIGA Cancer, Liège, Belgium

    “We have tested the RT kit FastGene Scriptase II in comparison with other kits, like Protoscript II (NEB) and Superscipt II (Invitrogen) and we have noted that the results are similar. Additionally, we can make more “runs” for a better price!”

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